qPCR 每次结果都不太一样？！究竟为哪般？

写在前面

同样是做荧光定量 PCR 实验，用了文献里的方法，照搬了人家的引物，为什么结果总是不太一样？

同样是做荧光定量 PCR 实验，用了文献里的方法，照搬了人家的引物，为什么结果总是不太一样？

我们往往谨慎对待：引物、探针、Ct 值等，但也有一些小东西会被忽视，比如：ROX™。也许很多同学的第一反应是：总听人说起 ROX™，但它是什么？它在荧

光定量 PCR 里起到什么作用呢？

其实和 FAM™、VIC™、SYBR™ Green 类似，ROX™ 也是一种在 qPCR 反应中能被 qPCR 仪检测到的荧光染料分子。但与其他染料不同，ROX™ 是一种惰性参比染料，也就是说，其荧光信号并不随着 PCR 扩增而增强。相反，ROX™ 的荧光信号值在反应中是基本保持不变的。

ROX™ 有什么用呢？

其实，在 qPCR 反应中有许多反应本身的物理因素会影响信号检测，从而造成孔间数据的差异。例如：PCR 反应板本底信号不均一，PCR 管盖厚度有差异，同一反应体系在分装时出现了差异等因素。ROX™ 能帮助我们通过均一化校正消除这些因素的误差，从而提高数据精确性。

ROX™ 的工作原理：

请大家注意看板上的两个孔，我们在每个孔中加入「完全等量」的样本，然后进行扩增。很快，30 个循环完成了。在每一个循环中，我们的仪器都会读取出一个荧光信号值。

理论上仪器检测出这两个孔的信号值应该是完全相同的，因为刚开始的时候样品是完全一样的。但实际上，由于移液器加样存在误差，耗材孔间不同等一系列差异，这两孔检测出的信号值并不相同。幸运的是，我们在两个孔中都加了相同的 ROX™，而我们的仪器也同时读取了 ROX™ 的信号值。

可以看到，ROX™ 信号和 qPCR 反应荧光信号都有差异。仔细思考大家会发现，反应本身的这些物理差异会对 ROX™ 信号和 qPCR 反应的荧光信号造成同等程度的影响。

重要的是，我们的仪器会在每一个循环中检测每一个反应孔的这两种信号，然后在反应结束后自动进行均一化处理。结合仪器自身的一系列荧光校准参数，最终您的数据精度会得到显著提高。顺便提一下，最终这个值也就是我们所说的 Rn 值，也表示报告基团的标准化荧光值。

两个关于 ROX™ 的重点：

第一，除非有些特殊情况，Applied Biosystems™ 提供给您的荧光定量预混液已经包含了最佳浓度的 ROX™，因此您无需再额外添加。

第二，所有 Applied Biosystems™ 实时荧光定量 PCR 软件是默认检测 ROX™ 并使用均一化数据，这会帮您提高数据精确性。如果您选用的试剂盒或者预混液不含 ROX™，依据您对实验的精度的要求不同，您可以另外采购 ROX™ 摸索最佳浓度优化实验，您也可以将参比荧光染料选项改为 None（无），放弃 ROX 校正。在没有 ROX™ 存在的情况下，我们建议选择参比荧光为 None 进行数据分析。